در فرآیند Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction یا RT-PCR از نمونه RNA به عنوان توالی الگو در PCR استفاده می‌شود. این فرآیند خصوصاً جهت بررسی تغییرات بیان ژن در سلول‌ها، بافت‌ها و ارگانیسم‌ها اهمیت دارد. در RT-PCR از نمونه‌های مورد بررسی RNA استخراج شده و طی فرآیند رونویسی معکوس و با استفاده از آنزیم Reverse Transcriptase ابتدا به DNA مکمل یا cDNA تبدیل می‌شود. میزان بیان هر ژن از سطح mRNA آن در نمونه مورد نظر از مقدار cDNA تکثیر شده در PCR تعیین می‌شود.
پرایمرهای مورد استفاده برای سنتز cDNA می‌تواند شامل پرایمرهای غیراختصاصی مانند مخلوطی از هگزامرهای تصادفی (Random Hexamer) و یا توالی‌های Oligo dT باشد. همچنین در مواردی که فرآیند رونویسی معکوس هدف مشخصی داشته باشد، می‌توان از پرایمرهای اختصاصی نیز استفاده کرد.
Random Hexamerها، مخلوطی از تمام ترکیبات احتمالی شش نوکلئوتیدی هستند که به طور تصادفی به RNA الگو متصل می‌شوند. پرایمرهای Oligo dT مکمل دُم پُلی A مولکول‌های mRNA هستند و اجازه سنتز cDNA را فقط از مولکول‌های mRNA می‌دهند.
فرآیند RT-PCR به صورت تک مرحله‌ای و دو مرحله‌ای انجام می‌شود.
Two Step RT-PCR
در RT-PCR تک مرحله‌ای، مرحله اول که سنتز cDNA از روی RNA الگو است و مرحله PCR که تکثیر cDNA است در یک ویال انجام می‌شود. در این فرآیند لازم است پرایمرهای هر دو مرحله، آنزیم Reverse Transcriptase و آنزیم DNA Polymerase به همراه مخلوط dNTPها و بافرهای مورد نیاز در یک مخلوط واکنش موجود باشند. از مزایای RT-PCR تک مرحله‌ای می‌توان به کاهش مصرف نمونه، کاهش زمان آماده سازی واکنش، کاهش احتمال خطاهای اندازه گیری و Pipetting و کاهش احتمال آلودگی اشاره کرد.
One Step RT-PCR
در RT-PCR دو مرحله‌ای، ابتدا سنتز cDNA صورت گرفته و سپس cDNA ساخته شده با استفاده از پرایمرهای اختصاصی در ویال دیگری جهت انجام PCR استفاده می‌شود. در این حالت از انواع PCR ترنسکریپتاز معکوس، cDNA در یک واکنش سنتز می‌شود و سپس از مقدار cDNA برای آزمایش PCR بعدی استفاده می‌شود. در این فرآیندها، به دلیل طولانی تر بودن مراحل آماده سازی احتمال خطا و آلودگی بیشتر می‌شود، اما مزیت این روش امکان استفاده چند باره از cDNA سنتز شده برخلاف RT-PCR تک مرحله‌ای است.
