Real Time PCR
در فرآیند PCR معمولی، محصولات PCR از طریق الکتروفورز روی ژل تجزیه و تحلیل می‌شوند که معمولاً فرآیندی زمان‌بر است. اما در تکنیک Real time PCR تجزیه و تحلیل بیان ژن یا محصولات در همان مراحل تکثیر، صورت می‌گیرد و دیگر نیازی به Run کردن نمونه‌ها روی ژل آگارز وجود ندارد. به این منظور میزان نوکلئیک اسید مورد نظر با استفاده از رنگ فلورسنت خاص یا استفاده از الیگونوکلئوتیدهای دارای مارکر فلورسنت کمی شده و به صورت اعداد قابل دست‌یابی است. در این روش‌ها دوربینی برای تشخیص فلورسانس و کامپیوتر و نرم افزار برای پردازش داده‌ها همزمان با PCR مورد نیاز است. بسته به منبع تحریک موجود و فیلترهای تشخیصی، ممکن است از انواع رنگ‌های فلورسنت در qPCR استفاده شود. در دو روش معمول استفاده از Real-time PCR، رنگ فلورسنت SYBR Green و پروب‌های TaqMan استفاده می‌شود.
Multiplex PCR
Multiplex PCR نوعی PCR است که در یک واکنش با استفاده از چندین مجموعه پرایمر، بیش از یک توالی هدف تکثیر می‌شود. این فناوری نسبت به انجام واکنش جداگانه برای هر توالی ژنی کم هزینه‌تر، سریع‌تر و از لحاظ تجزیه و تحلیل ژنتیکی به واسطه یکسان بودن شرایط آزمایش در هر واکنش، قابل مقایسه‌تر و دقیق‌تر است. همچنین در این روش از میزان DNA الگو کمتری استفاده می‌شود.
طراحی و ساخت کیت‌های Multiplex PCR چالش‌های متعددی دارد و بهینه سازی بافرها و استفاده از آنزیم‌های Hot start در این روش بسیار مهم است. همچنین با توجه به این که در Multiplex PCR از چندین جفت پرایمر استفاده می‌شود، در طراحی پرایمرها باید فاکتورهای زیر نظر گرفته شود:
دمای ذوب (Tm) پرایمرها باید یکسان یا دارای حداکثر 1 – 2 درجه سانتی‌گراد اختلاف باشد.
جهت جلوگیری از تداخل در روند تکثیر DNA، پرایمرها نباید دارای توالی مکمل متقابل باشند.
پرایمرها برای مناطق SNPs و یا مناطق با همسانی بالا طراحی نشوند.
Hot start PCR
با توجه به این که در هنگام آماده سازی مخلوط واکنش در دمای اتاق، احتمال اتصال غیر اختصاصی پرایمرها و تشکیل پرایمر دایمر و در نتیجه تکثیر نواحی غیراختصاصی وجود دارد، در این روش با مهار فعالیت آنزیم Taq DNA Polymerase در دماهای پایین‌تر به کمک آنتی‌بادی‌ها یا اصلاح کننده‌های شیمیایی که با آمینواسیدهای موجود در پلیمراز پیوند برقرار می‌کنند، از تشکیل محصولات غیر اختصاصی جلوگیری می‌شود و لذا حساسیت و اختصاصیت PCR افزایش می‌یابد.
