Poly Chain Reaction یا PCR روشی برای تکثیر توالی‌های کوچکی از DNA است که در آن از آنزیم DNA Polymerase جهت سنتز رشته‌های جدید DNA از روی توالی الگوی تک رشته‌ای استفاده می‌شود. PCR عمدتاً بر اساس یک سری چرخه حرارتی با افزایش و کاهش دمای متناوب (20 تا 40 تکرار) صورت می‌گیرد. بنابراین، در یک چرخه حرارتی PCR با 30 تکرار، بیش از یک میلیارد نسخه DNA را از یک نسخه الگو تولید می‌کند.
از انواع روش‌های PCR در انواع حوزه‌های زیست شناسی، پزشکی، تشخیص، درمان و … استفاده می‌شود. برخی از کاربردهای PCR عبارتند از بررسی بیان ژن، تشخیص ژنوتایپ، تجزیه و تحلیل جهش‌های ژنتیکی، متیلاسیون‌ها، کلونینگ، توالی‌یابی DNA و ….
در مخلوط واکنش PCR اجزاء زیر وجود دارند:
- DNA الگو که حاوی توالی مورد نظر جهت تکثیر یا ارزیابی است.
- آنزیم DNA Polymerase که با استفاده از دئوکسی نوکلئوتید تری فسفات‌های موجود از روی توالی هدف رشته جدید را سنتز می‌کند.
- پرایمرها قطعات کوچک تک رشته‌ای (حدود 20 نوکلئوتیدی) هستند که مکمل بخشی از DNA الگو بوده و پس از اتصال به آن منجر به شروع واکنش‌های سنتز قطعات جدید می‌شوند.
- dNTPها یا واحدهای دئوکسی نوکلئوتید تری فسفات که واحدهای سازنده رشته‌های جدید هستند.
- یون منیزیم فاکتور کمک کننده‌ای جهت تشکیل پیوند بین پرایمر و نوکلئوتید‌ها است. همچنین اتصال پرایمر و DNA الگوی باز شده را نیز تسهیل می‌کند.
مراحل مختلف یک واکنش PCR به شرح زیر است:
- Initialization یا آماده سازی اولیه: طی این واکنش، مخلوط آماده شده به مدت 5 تا 10 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد انکوبه می‌شود. مرحله آماده سازی منجر به فعال سازی آنزیم DNA پلیمراز و سایر واکنش‌دهنده‌ها در واکنش می‌شود.
- Denaturation: در این مرحله رشته الگوی DNA، واکنش به مدت 10 تا 30 ثانیه تا 95 درجه سانتیگراد گرم می‌شود تا پیوندهای هیدروژنی ضعیف بین دو رشته DNA شکسته شده و رشته‌ها از هم جدا شوند.
- Annealing: در این مرحله، پرایمرها به تک رشته‌های DNA متصل می‌شود. برای اتصال پرایمرها، دمای واکنش معمولاً به مدت 10 تا 30 ثانیه تا دمای 50 تا 65 درجه سانتیگراد کاهش می‌یابد تا پرایمرها فرصت داشته باشند به تک رشته DNA الگو متصل شوند. دمای مطلوب برای اتصال بستگی به دمای ذوب (Tm) پرایمرها دارد. پس از اتصال پرایمر به الگو، DNA پلیمراز می‌تواند، پلیمریزاسیون dNTPها را بر روی الگو آغاز کند.
- Extension: در مرحله Extension پلیمریزاسیون dNTPها در جهت ’5 به ’3 روی رشته الگو ادامه می‌یابد. از آنجاییکه دمای مطلوب برای عملکرد DNA پلیمراز 72 درجه سانتیگراد است دمای واکنش 30 ثانیه تا 72 درجه افزایش داده می‌شود. مدت زمان مرحله Extension، به طول DNA الگوی اصلی و سرعت آنزیم DNA پلیمراز بستگی دارد.
- Final Elongation: در آخرین چرخه Extension دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه حفظ می‌شود تا DNA تک رشته‌ای باقی مانده پس از آخرین چرخه PCR به طور کامل طویل شود. سپس دما تا 4 درجه سانتیگراد کاهش یافته تا نمونه‌ها تخریب نشوند.
در تنظیم دستگاه PCR یا ترموسایکلر ۳ مرحله Denaturation سپس Annealing و در نهایت Extension در 20 الی 40 سیکل تنظیم می‌شود. دمای دقیق و زمان هر کدام از مراحل به شرایط آزمایش، شرایط پرایمرها و شرایط DNA الگو مرتبط است.
